Sequenziamento del DNA: chain terminator (Sanger) - 2
Nel frattempo vi ho ritrovato l'immagine incriminata di X-Files
:
Comunque, eravamo rimasti ai ddNTP, che dicevamo servono come terminatori della sintesi del nuovo filamento di DNA.
Nel sequenziamento di Sanger questi ddNTP vengono marcati con fluorescenza o, soprattutto in passato, con una bassa radioattività. A cosa serve questo accorgimento? Lo vediamo subito:
Vengono preparate 4 provette con lo stesso DNA. In ognuna vengono messi i 4 dNTP normali (ovvero che non fermano la polimerasi), la DNA polimerasi (non una eh, si intende tante proteine!) e una bassa quantità di un terminatore solo, uno diverso per ogni provetta.
A questo punto viene fatta partire la sintesi in ogni provetta. Statisticamente sarà molto più facile che un dNTP capiti nella polimerasi anzichè un ddNTP.
Quindi, se questo era il nostro filamento di partenza:
ATGGCCATTGA
avremo, ad ex nella provetta con ddNTP che corrisponde a T, questi filamenti:
AT
ATGGCCAT
ATGGCCATT
ATGGCCATTGA
Dove il nucleotide azzurro corrisponde ad un ddNTP terminatore. Questa cosa viene fatta per ognuna delle 4 basi.
Ora, esiste un metodo, chiamato
elettroforesi, che permette di dividere i filamenti secondo il loro peso: la soluzione viene caricata in un gel polimerico, a cui viene applicata una corrente. E' un po' come applicare la stessa forza a oggetti di diverso peso: immaginate di avere una biglia una palla da calcio e una da bowling; se applicate la stessa forza a tutte, quella che si muoverà più lontana sarà la biglia, seguita dalla palla da calcio e da quella da bowling, e la loro distanza sarà proporzionale al loro peso.
Nella elettroforesi, le quattro provette vengono caricate una di fianco all'altra, e sottoposte alla stessa corrente:
Guardate l'immagine di sinistra: C,T,A e G corrispondono ai 4 ddNTP terminatori, mentre ogni blocchettino (banda) corrisponde a un filamento, ognuno più pesante dell'altro di un solo nucleotide. La marcatura radioattiva o a fluorescenza serve quindi a evidenziare le bande!
Dovreste aver capito ora, leggendo dal basso, saltando da una banda all'altra con un solo nucleotide di differenza è possibile ricreare la sequenza del DNA in esame!!!
P.S. mi sono accorto ora che nell'immagine manca una banda rossa... Non male per una immagine presa da un sito di una università!
Ad ogni modo fate come se ci fosse!